Диагнозата ботулизъм се основава на идентифицирането на Clostridium botulinum токсин в лабораторията и на наблюдението на клиничните симптоми, дори ако понякога те са неспецифични. Всъщност болестта може да бъде объркана със синдрома на Гилен-Баре, полиомиелит, инсулт, миастения гравис и парализа на кърлежи.
При хранителния ботулизъм, картината на нервно-мускулните нарушения и поглъщането на потенциално замърсени храни са важни улики. Едновременното проявление при поне 2 пациенти, които ядат една и съща храна, опростява диагнозата. Потвърждението се получава чрез изолиране на микроорганизма с култура на проби от предполагаема храна или изпражнения на пациента и с идентифициране на ботулинов токсин в храни или биологични материали (като кръв, стомашен сок и повръщане).
От друга страна, при ботулизма на раните, търсенето на серумния токсин или изолирането на Clostridium botulinum от проба от кожната лезия потвърждават диагнозата.
